[发明专利]棒状细菌的proB基因的突变体

说明书

本发明涉及一种具有γ-谷氨酰激酶活性的酶。更特别地，本发明鉴定了在氨基酸序列的第149位或类似氨基酸位置(a comparableposition)具有除甘氨酸之外的蛋白质氨基酸(proteinogenic aminoacid)的那些酶。

具有γ-谷氨酰激酶活性的酶优选用于发酵生产L-脯氨酸。从谷氨酸起始的L-脯氨酸生物合成途径示于方案1。

-方案1

已知可以通过发酵例如棒状细菌(coryneform bacteria)菌株、特别是谷氨酸棒杆菌菌株而生产氨基酸。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有性质。

为改良这些微生物的性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物有抗性或调节重要性代谢物是营养缺陷的并产生氨基酸的菌株。一种已知的抗代谢物是脯氨酸类似物3，4-脱氢-DL-脯氨酸(DHP)。

一段时间以来，重组DNA方法也已经用于改良生产L-氨基酸的棒杆菌菌株的改良，其通过扩增各个氨基酸生物合成基因，并研究对氨基酸生产的作用而进行改良。

谷氨酸棒杆菌基因组的核苷酸序列在EP-A-1108790中描述，并且储存在国立医学图书馆(Bethesda，MD，USA)的国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中，登记号为NC_003450.2和BX927148.1至BX927157.1。

Sleator等报道了通过突变Listeria monocytogenes proB-Gen而引起脯氨酸生物合成过量生产的可能性(Appl.Environ.Microbiol.2001，67，4560-5)。所述突变在该文中描述并称作编码γ-谷氨酰激酶的proB基因，其具有如下突变：V121I、A144V和E146K。另外，需要提及的是发生这些突变的区域良好对应于也在其它生物体中作为有益突变的靶区域而被鉴别的区域。

因此本发明的目的是产生γ-谷氨酰激酶的进一步突变的以及当合适时改良的蛋白质变体，它们可有利地用于L-脯氨酸的发酵生产的技术方法中。

这一目的及其它未详细说明但从本领域可明显得出的目的通过权利要求1所述的γ-谷氨酰激酶即可实现。权利要求2描述优选的酶。权利要求3和4分别涉及编码这些酶的核苷酸序列，而权利要求5描述重组产生的具有刚刚提及的核苷酸序列的载体。最后，权利要求5涉及本发明的借助于所述酶生产L-脯氨酸的方法。

通过提供在第149位或类似氨基酸位置具有除甘氨酸之外的蛋白质氨基酸的γ-谷氨酰激酶(proB基因的产物)，令人惊奇地且有利地实现了所述目的。与野生型酶相对比，具有合适突变的γ-谷氨酰激酶有助于在发酵生产过程中以改良的方式生产L-脯氨酸。使用本发明的方法可以使得宿主生物体或者发酵方法的选自如下一组的一或多个参数的性能基于起始菌株或亲代菌株或者使用所述酶的发酵方法改良至少0.5％、至少1％、至少1.5％或者至少2％，所述的组为：产物浓度(每体积的产物)、产物产量(形成的产物/消耗的碳源)及产物形成(每体积和时间形成的产物)，或者其它方法参数及其组合。

优选提供γ-谷氨酰激酶，其中在本发明定义的氨基酸位置或者类似位置存在选自如下的氨基酸、优选L-氨基酸：Lys、Asn、Arg、Ser、Thr、Ile、Met、Glu、Asp、Ala、Val、Gln、His、Pro、Leu、Tyr、Trp、Cys或Phe。(所述氨基酸、包括甘氨酸，在本领域也称作蛋白质氨基酸)。非常优选的是在所述酶的第149位用L-天冬氨酸取代甘氨酸(G149D)。最优选的是如上所述的本发明的γ-谷氨酰激酶，其长度为369±40、优选±20、更优选±10及特别优选±5个氨基酸或者±3个氨基酸。已知称作氨基肽酶的宿主固有的酶能从形成的蛋白质中切割下N末端甲硫氨酸。进一步已知从蛋白质的C末端切割下1或2个及不超过3个氨基酸即使削弱所述酶活性，最多也仅是可忽略程度地削弱。然而，所述酶由于附加某些融合蛋白而可以增加长度(见下文描述)。