[发明专利]新型霍乱弧菌菌株

说明书

发明领域

本发明涉及新型霍乱弧菌菌株，及其制备和作为具有诱导抗菌抗毒免疫的口服活菌苗的应用。

背景技术

霍乱是由霍乱弧菌引起的急性肠道传染病，是以发病急、传播快、波及范围广、能引起大流行为特征的传染病之一，被列为国际检疫传染病之一，也是我国传染病法规定的甲类传染病之一。自1883年Koch首次分离出霍乱弧菌以来，人们就对其预防和治疗开始了探索。目前普遍认为，发展安全、高效、经济的菌苗是预防该疾病最有效可靠的方法，截至目前已研制出多种形式的霍乱菌苗。二十世纪六七十年代，霍乱弧菌的研制侧重于发展非肠道菌苗，包括全细胞死菌苗、类毒素苗和亚单位苗等，但效果均不理想。进入八十年代后，随着霍乱分子生物学研究的深入、基因重组技术的发展以及对肠道免疫重要性的认识，霍乱菌苗的研制朝重组口服活菌苗的方向发展。

霍乱的免疫特征以抗菌免疫为主，抗菌与针对霍乱毒素的抗毒免疫协同作用，刺激肠道粘膜产生分泌性抗体。自然感染霍乱可以获得有效而稳固的免疫力，持续时间长达三年之久，所以近年来许多研究者致力于发展模拟霍乱自然感染过程的口服活菌苗。其研制有两条途径：一是以其它肠道菌为受体菌表达霍乱的有效保护性抗原；二是将霍乱弧菌产毒株的主要毒力基因失活，保留有效抗原基因，构建霍乱减毒活菌苗。目前具有代表性的是美国马里兰大学菌苗发展中心(CVD)研制的CVD系列，较为成熟的CVD103-HgR(出发菌株为569B，CVC，Inaba)和CVD111(出发菌株为N16117，EVC，Ogawa)目前已经或正在进行大量的临床及现场实验，此外还有Peru-14、Peru-15等也显示有较好的保护力。但是，溶原性噬菌体CTXΦ的存在及其水平转移无疑给减毒活菌苗在现场应用的生物安全性带来了潜在的隐患，因为它可以在适当的条件下携带ctxAB水平转移，如果在自然界中可能遇到菌苗株并感染，则可使活菌苗获得毒力。尽管这一概率很低，但从菌苗的生物安全性角度，是一个必须考虑的问题。

IEM101是本室从天然不含CTXΦ基因组的El Tor型菌株中筛选的一株菌苗候选株，动物实验安全无毒，有较好保护力；人体志愿者一次口服免疫，无致泻性，可定居4-9天，能刺激机体产生血清和肠道局部特异性保护抗体，无明显不良反应，是较为理想的菌苗候选株。但是，由于该候选株不含毒素基因，故不引起抗毒免疫，而霍乱毒素B亚单位可刺激机体产生良好的抗毒免疫，同时该亚单位只起到与GM1受体结合的作用而无致泻性。

研究表明，CTXΦ在染色体上的溶原整合状态可以使该菌获得对同种噬菌体再感染产生抗性的能力，即噬菌体免疫。该免疫是由RS2序列中的rstR基因介导的，它是一种抑制基因，编码抑制蛋白，抑制rstA基因的转录表达，而rstA与CTXΦ的整合复制有关，从而一方面维持了CTXΦ的溶原整合状态，另一方面使再进入菌细胞的CTXΦ基因组不能复制与整合，并且这种免疫由于CTXΦ家族成员中rstR基因的不同而表现为生物型特异性。因此，在发展具有不感染CTXΦ，避免获得毒力恢复的生物安全性霍乱活菌苗方面，rstR具有重要的作用。

发明内容

本发明的概述

根据本发明，提供了：

1、一种新型霍乱弧菌菌株，其特征在于导入了能够介导噬菌体免疫的rstR基因和能够诱导保护性抗毒免疫的ctxB基因，二者在不含CTX基因组的霍乱弧菌菌株为出发菌株构建的，以thyA基因为选择压力的质粒染色体致死平衡系统中高效表达，构建成具有CTX^ET感染超免疫的、并具有诱导抗菌抗毒免疫的菌苗。

2、按照以上项1所述的霍乱弧菌菌株，其特征是以IEM101为出发菌株，构建thyA基因精确缺失的营养缺陷株IEM101-T。IEM101是不含CTX基因组的E1 Tor型菌株。

3、按照以上项1所述的霍乱弧菌菌株，其特征是用PCR方法获得大肠杆菌的thyA基因和El Tor来源的rstR基因，ctxB基因系从质粒pBR中酶切获得。

4、根据以上项1所述的霍乱弧菌菌株，特征在于用去除了氨苄青霉素抗性基因的平衡质粒，使克隆的基因高拷贝的表达。

5、根据以上项1所述的霍乱弧菌菌株，特征在于加入了新的功能基因或替换其它基因进行菌苗改造。

6、根据以上项1所述的霍乱弧菌菌株，特征在于加入或替换其它rstR基因，和/或加入其它保护性抗原基因而构建成肠道多价菌苗。