[发明专利]通过发酵生产L－谷氨酰胺的方法和产生L－谷氨酰胺的细菌

说明书

发明领域

本发明涉及属于棒状细菌的产生L-谷氨酰胺的细菌和生产L-谷氨酰胺的方法。L-谷氨酰胺是工业上有用的氨基酸，可作为调味品，肝脏功能促进剂，氨基酸输液，广泛的氨基酸制剂等等的成分。

背景技术

为了采用发酵方法生产L-谷氨酸，已经大量地使用通过育种改进微生物的方法。就是说由于在许多情况下野生型菌株本身生产L-谷氨酸的能力非常低，已知通过突变给予辅源营养或类似物特性的抗性或给与代谢调节突变的方法和将这些结合使用的方法。虽然采用上面的方法获得了合适产量的L-谷氨酰胺，但是进一步改进发酵产量以便在工业上以低成本生产-谷氨酰胺是绝对必要的。

此外，L-谷氨酰胺发酵也遇到了L-谷氨酸副产物的问题。例如在日本待审专利公开号3-232497中建议了解决该问题的方法。虽然，该方法将L-谷氨酸的生产抑制到一定的程度，但是仍然有L-谷氨酸副产物并且L-谷氨酰胺的产量是不够的。

由于上文提到的L-谷氨酰胺产生菌的这样的改进利用了用诱变剂等处理宿主细菌和从掺入随机突变的细菌选择显示L-谷氨酰胺产率改进的菌株的方法，它们需要更多的劳动和遇到困难。

发明内容

本发明的目的之一是找到具有改进的L-谷氨酰胺产率和抑制L-谷氨酸副产物的特性的棒状细菌，从而提供了利用具有这样的特性的菌株生产L-谷氨酰胺的方法。

本发明的发明人进行了刻苦的研究以便达到上面的目的。结果它们发现胞内谷氨酰胺合成酶活性增强的棒状细菌菌株与具有野生型菌株的谷氨酰胺合成酶活性的菌株相比显示更优秀的L-谷氨酰胺产生能力和显著抑制副产物L-谷氨酸的产生。再者，他们发现同时加强谷氨酰胺合成酶活性和谷氨酸盐脱氢酶活性改进了L-谷氨酰胺的产率。此外他们成功地分离了编码L-谷氨酰胺合成酶的新基因和编码L-谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶的新基因，因此完成了本发明。

就是说，本发明提供了下面的内容。

(1)棒状细菌，具有L-谷氨酰胺产生能力并且已经被修饰以便应该加强胞内谷氨酰胺合成酶活性。

(2)根据(1)的细菌，其中通过增加谷氨酰胺合成酶基因的表达量加强谷氨酰胺合成酶活性。

(3)根据(2)的细菌，其中通过增加编码谷氨酰胺合成酶的基因的拷贝数或修饰该基因的表达调控序列以便编码该细菌的胞内谷氨酰胺合成酶的基因的表达获得加强，增加了谷氨酰胺合成酶基因的表达量。

(4)根据(1)的细菌，其中通过腺苷化缺失对胞内谷氨酰胺合成酶的活性控制加强谷氨酰胺合成酶活性。

(5)根据(4)的细菌，其中通过腺苷酸化控制其胞内谷氨酰胺合成酶的活性被一个或多个携带的其腺苷酸化活性控制被缺失的谷氨酰胺合成酶所缺失，在该细菌细胞中谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶活性降低，在该细菌细胞中PII蛋白质活性降低。

(6)根据(1)-(5)任一项所述的细菌，其中该细菌进一步被修饰以便其胞外谷氨酸脱氢酶活性得到加强。

(7)根据(6)所述的细菌，其中通过增加谷氨酸脱氢酶基因的表达量加强了谷氨酸脱氢酶活性。

(8)根据(7)的细菌，其中通过增加编码谷氨酸脱氢酶的基因的拷贝数或修饰该基因的表达控制序列增加谷氨酸脱氢酶基因的表达量，以便增加了编码细菌胞内谷氨酸脱氢酶的基因的表达量。

(9)生产L-谷氨酰胺的方法，包括在培养基中培养根据(1)-(8)任一项的细菌以产生和在培养基中积累L-谷氨酰胺并且收集L-谷氨酰胺。

(10)编码下面(A)或(B)定义的蛋白质的DNA：

(A)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质，

(B)具有包括一个或几个氨基酸残基的取代，缺失，插入，叠加或倒置的SEQ ID NO：2的氨基酸序列并且具有谷氨酰胺合成酶活性的蛋白质。(11)根据(10)的DNA，它是下面(a)或(b)定义的DNA：

(a)含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核苷酸编号659-1996位的核苷酸序列的DNA，

(b)在严谨条件下与SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核苷酸编号659-1996位的核苷酸序列，或可从该序列制备的探针杂交并且编码具有谷氨酰胺合成酶活性的蛋白质的DNA。(12)编码下面(C)或(D)定义的蛋白质的DNA：

(C)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质，