[发明专利]草原疯草毒素疫苗

说明书

一、所属领域

本发明属于生物化学合成的一种植物毒素疫苗，涉及到毒理学、有机合成和免疫学技术领域，特别涉及一种草原疯草毒素疫苗。

二、背景技术

疯草是豆科黄芪属和棘豆属有毒植物的总称，也是世界范围内危害草原畜牧业最严重的一类毒草。在我国，疯草广泛分布于西北、华北、西南的广大牧区，危害面积达400万公顷。疯草所含主要有毒成分吲哚兹定生物碱—苦马豆素(swainsonine，SW)，能导致大批动物中毒死亡，更为严重的是引起母畜流产、不孕、胎儿畸形和公畜不育，造成巨大的经济损失。尽管近20年来国内外在疯草的有毒成分、毒理机制、化学防除等方面取得了一定进展，但迄今还没有特效的防治动物疯草中毒的方法，致使疯草中毒问题日趋严重，成为草原畜牧业的大患。

目前，国内外所采取的防治动物疯草中毒的方法包括：

①禁止在疯草多的草场放牧动物。

②人工挖除。为了创建安全牧场，可以人工将疯草挖除，由于发芽部位多在地表下2m-3m深处，而且疯草的再生能力很强，只有挖除的深度达到地下10m，疯草才不会再度发芽。由于疯草落入土壤的种子可数年不失发芽能力，因此挖除应在结荚前进行，并要连续挖除几年才能根除。也可深翻后种植其它优良牧草，达到以草治草的目的。

③化学防除。从1952年开始，美国就多次报道用2，4-D丁酯灭除兰伯氏棘豆和绢毛棘豆。我国也先后用2，4-D丁酯灭除茎直黄芪、甘肃棘豆、黄花棘豆、小花棘豆、毛瓣棘豆和冰川棘豆。但是结果都不理想，因其不能杀死疯草的地下发芽点，所以翌年又会再生，而且对其它牧草药害也较重。

百草敌单独使用，对黄花棘豆的防除效果为80％左右，不甚理想，但对其它牧草安全性好。

李建科等筛选出JDC-II药剂，杀灭棘豆草的效果可达100％，并且可以使根部腐烂。缺点是对伴生牧草有一定的杀伤作用。

疯草属豆科植物，除含有毒素外，还具有丰富的营养成分，粗蛋白的含量在12％-20％，上述的方法都不能合理利用疯草，变废为宝，变害为利，使动物能充分利用我国丰富的疯草资源。疯草的抗逆性强，能抗干旱、抗风沙、耐寒冷，特别适合于我国西部的草原生长。目前所采用的人工挖除和化学防除的方法，会使草原进一步沙漠化，破坏草原生态系统，化学防除还会有大量的药物残留，给环境带来污染。

三、发明内容

本发明的目的在于，提供一种应用毒理学、免疫学及有机化学的原理制备的草原疯草毒素疫苗。用该疫苗接种动物，达到两个目的：一是，获得高滴度的抗苦马豆素抗血清，建立分析苦马豆素特异性强、灵敏度高、操作简便的分析方法。二是，使动物获得疯草毒素的免疫力并在采食疯草时得到保护，这样不仅可以大大减少疯草造成的损失，而且动物还可以安全利用疯草资源。动物安全利用了疯草，不仅能变害为利、变废为宝，而且也控制了疯草的蔓延，保护了环境，从而获得巨大的经济效益和生态效益。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是，首先将溴乙酸与N-羟基琥珀酰亚胺反应成活性酯，再与苦马豆素合成为N-羧甲基苦马豆素，最后与牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)缩合成为SW-BSA，透析后冰冻干燥，完全福氏佐剂乳化即为SW疫苗。

具体制备按以下步骤进行：

第一步，SW—活性酯(季铵盐)的合成：

反应式

操作程序为：取SW 17.3mg～173mg(0.1mmol～1mmol)在干燥的丙酮液中完全溶解后，加入用溴乙酸制备的活性酯23.6mg～236mg(0.1mmol～1mmol)，80±5℃搅拌回流反应9±0.5h，过滤，丙酮洗涤，五氧化二磷真空干燥。计算产率。MP、IR、元素分析鉴定。

第二步，SW—BSA的合成：

反应式

操作程序为：取晶状BSA 167.5mg～1675mg(0.0025mmol～0.025mmol)，完全溶于4～20mL蒸馏水后，加入制备的季铵盐40.9mg～409mg(0.1mmol～1mmol)，冰浴搅拌反应18±0.5h。测定结合率后反应产物装入透析袋中，蒸馏水中透析24±0.5h，中间更换3次蒸馏水。冻干透析袋中共轭物。计算产率。

第三步，SW—BSA的结合率计算：