[发明专利]苏云金杆菌cryIA(c)基因在蜡质芽孢杆菌中营养期表达质粒的构建

权利要求书

1、一种分离和克隆苏云金杆菌杀虫毒蛋白基因cryⅠA(c)的方法，它包括：

A、苏云金杆菌基因组DNA的提取；

B、苏云金杆菌基因组DNA的纯化；

C、从苏云金杆菌基因组DNA中分离cryⅠA(c)基因；

D、用限制性内切酶部分消化进行cryⅠA(c)基因作图。

2、权利要求1的方法，其特征在于苏云金杆菌基因组DNA的提取：选择供试菌株培养，将培养至饱和状态的细菌培养物沉淀，用TE缓冲液重悬，加入10％的SDS和蛋白酶K，于37℃下温育1小时，加入5M的NaCl，充分混匀，再加入CTAB/NaCl溶液混匀后，于65℃温育10分钟，加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，离心4～5分钟，将上清液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心5分钟，将上清液转入另一支新管中，加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，稍加离心，用1ml70％乙醇洗涤，离心5分钟，弃上清，稍加干燥，重溶于10ul的TE缓冲液，每次酶切反应用10-15ul。

3、权利要求1的方法，其特征在于苏云金杆菌基因组DNA的纯化：往盛有待纯化DNA溶液的1.5ml离心管中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，在旋涡混合器上剧烈振荡10秒，室温下离心15秒，用200ul的微量移液器将含有DNA的上层(水)相小心地移入一只新管中，如果在水相和有机相交界处有白色沉淀物，则重新抽提有机相，合并水相；往DNA溶液中加入1/10体积的3mol/1 pH5.2的乙酸钠，在旋涡混合器上稍加振荡或用手指轻弹离心管壁几次使之混匀，加入2-2.5倍体积冰冷的100％乙醇，在旋涡混合器上振荡混匀并置于碎干冰上5分钟或更长时间，在固定角度离心机上离心5分钟，弃去上清，加入1ml室温的70％乙醇，颠倒离心管数次，在离心5分钟，弃上清，在真空干燥器中干燥沉淀，将干燥的沉淀物溶于适当体积的TE缓冲液(pH8.0)。

4、权利要求1的方法，其特征在于从苏云金杆菌基因组DNA中分离cryⅠA(c)基因：采用SphⅠ-NruⅠ内切酶，将基因组DNA溶液取18ul，加入灭菌的微量离心管中，加入2ul的10×Buffer K，混匀，加入1ul SphⅠ(10u/ul)、1ul NruⅠ(10u/ul)限制酶混匀，置于37℃下温育3小时，加入0.5mol/LEDTA(pH8.0)使终浓度达10mmol终止反应，酶切产物通过0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测，得到7.4kb的SphⅠ-NruⅠ酶切片段。

5、权利要求1的方法，其特征在于用限制性内切酶部分消化进行cryⅠA(c)基因作图：用低频率切割的不同限制性内切酶消化DNA，用³²P末端标记消化产物，5’末端可先用小牛肠碱性磷酸酶处理，再用T4多核苷酸激酶进行标记，3’末端可先用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow酶或T4 DNA聚合酶来标记，用第二种内切酶消化DNA片段，通过凝胶电泳分离产物，纯化那些仅单末端带放射性标记的DNA片段，用系列稀释酶法以相对高频度切割的限制性酶部分消化分离的DNA片段，电泳分离片段并进行自显影曝光，用放射性标记的DNA分子量标准，估算出片段的长度，推导出每种限制性内切酶的酶切位点数目，DNA图谱便告完成。

6、在蜡质芽孢杆菌的营养期表达质粒中构建苏云金杆菌cryⅠA(c)基因的方法，它包括：

A、质粒pEG434的构建；

B、将BtcryⅠA(c)基因插入质粒pEG434形成质粒pEG501；

C、质粒pBC601的构建。