[发明专利]C－反应蛋白测定方法和测定试剂

说明书

本发明涉及C-反应蛋白测定用试剂和测定方法，更详细地说就是涉及具有磷酸胆碱基团和阳离子性基团的化合物和C-反应蛋白的抗体的C-反应蛋白测定试剂、以及应用该试剂测定C-反应蛋白的方法、含有具磷酸胆碱基团的表面活性剂、具阳离子性基团的表面活性剂和C-反应蛋白的抗体的C-反应蛋白测定试剂、以及应用该试剂测定C-反应蛋白的方法。

作为急性相反应物质一种的C-反应蛋白(C-reactive protein)作为各种感染性疾病、炎症性疾病和发生组织破坏的疾病等诊断和过程观察的标记物，是临床检查领域内经常测定的一个项目。作为C-反应蛋白的测定方法，已知有使用和C-反应蛋白特异结合的抗体或抗血清的毛细管法、一维免疫扩散法、免疫比浊法、胶乳免疫比浊法等测定方法。这些测定方法利用抗原C-反应蛋白和抗体结合形成巨大凝聚体而检测种种凝聚。

例如，在胶乳免疫比浊法中，使用承载(致敏)抗体的粒径0.1～1微米的聚苯乙烯胶乳等载体，和相应的抗原发生抗原抗体反应时，反应液中的散射光增加，透过光减少，以吸光度或积分球浊度检测此变化就能够测定C-反应蛋白。但是，在观察此抗原抗体反应所致凝聚的方法中，已知会引起所谓“前带现象”(prozone phenomenon)的问题。所说的“前带现象”是因抗原和抗体相比有更高浓度，反而使浊度减少的现象。结果使测定时试样中抗原虽然有很高浓度，但得出低浓度的错误结论。为了避免此前带现象，必需将试样稀释、或增加使用的抗体而进行再次测定，使操作复杂化。

已知磷酸胆碱在钙离子存在下和C-反应蛋白特异结合，形成凝聚体[J.Immunol.,124,1396(1980)]。此外，已知使用对硝基苯基磷酸胆碱琼脂糖B层析柱进行亲合层析而精制C-反应蛋白[《检查と技术》，24(5),409(1996)]。还有，作为C-反应蛋白的定量方法，有使用含磷脂酰胆碱、胆固醇、氯化胆碱、钙等的试剂的方法(特开昭52-123295号公报)、使用含结合磷酸胆碱的高分子的试剂的方法、以及使用含结合磷酸胆碱的高分子和C-反应蛋白的特异抗体的试剂的方法(特开昭62-259063号公报)。此外，作为应用积分球浊度进行检测、使用胶乳试剂的C-反应蛋白测定方法，例如有使用协和梅迪克斯公司的C-反应蛋白用胶乳试剂(Extel CRP用EL1200)的方法。

本发明的目的在于提供避免前带现象、无需稀释含高浓度C-反应蛋白试样的测定方法及其所用的试剂。

本发明者们对上述课题进行了深入研究，结果发现，(A)使用具有磷酸胆碱和阳离子性基团的化合物和C-反应蛋白的抗体、或(B)使用具有磷酸胆碱基团的表面活性剂、具有阳离子性基团的表面活性剂和C-反应蛋白的抗体，能够测定试样中的C-反应蛋白，对于含高浓度C-反应蛋白的试样无需稀释就能避免前带现象而测定C-反应蛋白，从而完成了本发明。

即，本发明涉及一种C-反应蛋白的测定方法，其特征在于使用含有磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团的化合物和C-反应蛋白的抗体、或使用具有磷酸胆碱基团的表面活性剂、具有除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团的表面活性剂和C-反应蛋白的抗体来测定C-反应蛋白(发明1)。

此外，本发明涉及根据发明1记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于具有磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团的化合物中阳离子性基团为通式(Ⅰ)

[式(Ⅰ)中R¹、R²和R³相同或不同，表示氢、取代或非取代烷基、取代或非取代烯基，X₁^-表示无机阴离子或有机阴离子。]所示的基团(发明2)；根据发明1或2记载的C-反应蛋白的测定方法，其特征在于具有磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱外的阴离子基团的化合物为具有磷酸胆碱基团的单体和具有阳离子性基团的单体结合的共聚物(发明3)；根据发明3记载的C-反应蛋白的测定方法，其特征在于具有磷酸胆碱基团的单体和具有阳离子性基团的单体分别为具有磷酸胆碱基和乙烯基的单体、以及具有阳离子性基团和乙烯基的单体(发明4)；根据发明4记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于具有磷酸胆碱基团和乙烯基的单体和具有阳离子性基团和乙烯基的单体分别为2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱和氯化2-羟基-3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲基铵(发明5)；根据发明1记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于具有具有磷酸胆碱基团的表面活性剂为通式(Ⅱ)

[式(Ⅱ)中Y₁表示疏水基团。]所示的化合物(发明6)。