[发明专利]在转基因动物中产生靶分子和纯化该靶分子的方法

说明书

                         发明背景

近年来制备和纯化用于治疗和诊断目的的多肽已成为一项重要产业。重组多肽表达的早期尝试是利用质粒表达载体在细菌中进行的。例如，美国专利4,816,397公开了免疫球蛋白在细菌中的重组表达。这些方法由于需要打开或裂解细菌以获得作为含有细菌蛋白质和其它细菌成分的复杂混合液的一部分存在的重组多肽而受到限制。再一个限制是由重组多肽在细菌中的非天然氧化状态造成的，这种状态会导致不正确的多肽折叠。

这些问题中的一些通过多肽在哺乳动物细胞培养发酵系统中的重组表达而得到减轻。美国专利5,639,640公开了人促滤泡激素(FSH)在哺乳动物细胞培养物中的重组表达。不幸的是，操作这些哺乳动物细胞培养发酵系统极为昂贵，而且由此产生的多肽仍是含有生长培养基中存在的蛋白质的复杂混合物的一部分。

为了克服这些系统中存在的问题而作的努力导致了重组多肽在各种转基因动物系统中的转基因表达。这种努力使得可以高水平地转基因表达多肽，籍此消除制备重组多肽时对昂贵的哺乳动物细胞培养发酵系统的需求。然而，为了成为哺乳动物细胞培养系统的可行替代方法，维持这些动物的健康是重要的。而且，由此产生的多肽仍是奶蛋白质复杂混合物的部分(substituent)，因此需要方法从该混合物中纯化出这些多肽。

                         发明概述

本发明涉及在转基因动物中产生靶分子的方法及纯化该靶分子的方法。靶分子优选是靶多肽。本发明部分基于以下发现，即可以使靶多肽以无活性形式表达并分泌至转基因动物的奶中，然后再加以激活。这就使得可以避免由于在动物中以活性形式产生多肽而造成的复杂性。例如，已经发现在转基因动物的奶中生产某些蛋白质包括酶、生长因子、激素和细胞因子，会引起动物的健康问题。本发明的方法可以使这些问题最小化。本发明还涉及纯化生物系统如奶中存在的这些和其它靶分子的系统和方法。例如，这些系统和方法可以利用多价结合多肽，例如亲和配体，在奶中的转基因表达来纯化这些靶分子。优选地，该转基因多价结合多肽既能够结合靶分子又能结合预先选择的配体，例如可相分离(phase separable)的基质上的预先选择配体。

因此，一方面，本发明涉及在转基因动物中产生靶多肽的方法。该方法包括：产生处于无活性状态的多肽；获得此无活性多肽；和激活该多肽，以籍此提供靶多肽。

在一个优选实施方案中，多肽以无活性状态在转基因动物的组织或产物如体液(如奶)中产生。在一个优选实施方案中，从转基因动物获取含有无活性蛋白的组织或产物如奶。

在一个实施方案中，通过共表达靶多肽和结合多肽(该结合多肽可以结合该靶多肽并使之失活)，使靶多肽失活。在一个优选实施方案中，结合多肽和靶多肽以复合物形式存在于组织或产物如体液如奶中。

在一个优选实施方案中，靶多肽和结合多肽是配体和反配体(counterligand)，例如结合多肽是受体或配体、或它们的片段。在另一优选实施方案中，结合多肽是抗体或其片段。

在一个优选实施方案中，编码靶多肽的核酸处于组织特异性启动子的控制下，例如指导在乳腺上皮细胞中进行表达的启动子的控制下。在一个优选实施方案中，编码结合多肽的核酸处于组织特异性启动子的控制下，例如指导在乳腺上皮细胞中进行表达的启动子的控制下。优选地，编码靶多肽的核酸和编码结合多肽的核酸处于相同类型的启动子例如同一类型的组织特异性启动子的控制下。例如，两者均可以处于指导在乳腺上皮细胞中进行表达的启动子的控制下，如两者可以处于相同的或不同的奶特异性启动子的控制下。奶特异性启动子可以是例如酪蛋白、乳球蛋白、乳清蛋白或乳清酸性蛋白(WAP)的启动子。

在一个优选实施方案中，编码结合多肽的核酸还在结合多肽之外编码一段序列，其中该序列编码至少一个氨基酸。例如，该核酸可以再包括一个对于结合多肽的纯化有用的氨基酸。在一个优选实施方案中，可以在结合多肽之外添加至少一个氨基酸，例如可以与预先选择的配体如用于纯化结合多肽的配体(如6×HIS配体、纤维素结合域(CBD)配体、麦芽糖结合蛋白(MBP)的配体)结合的一个额外的氨基酸或多个氨基酸。可以与预先选择的配体结合的该氨基酸(或多个氨基酸)在本文中又称作结合部分(binding moiety)，例如能够结合预先选择的配体或基质的结合部分。