[发明专利]具有果胶乙酰酯酶活性的多肽和编码该多肽的核酸

说明书

                        发明背景

发明领域

本发明涉及具有果胶乙酰酯酶活性的分离多肽，和编码该多肽的分离核酸序列。本发明还涉及包含所述核酸序列的核酸构建物、载体、和宿主细胞，以及生成和使用所述多肽的方法。

相关技术的描述

果胶是植物细胞壁的重要结构成份。果胶的主链可以分成线性的同型聚半乳糖醛酸(无毛)区(可达200个1，4-连接的α-D-半乳糖醛酸(GalUA)残基)，和高度分支的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(有毛)区(由重复的α-(1，2)-L-鼠李糖-α-(1，4)-D-半乳糖醛酸二糖单位构成)。一般而言，大约半数的鼠李糖残基由中性寡糖替代，诸如阿拉伯聚糖、半乳聚糖、和阿拉伯半乳糖聚糖。大部分果胶物质还在有些α-D-半乳糖醛酸残基处发生酯化，在C-2和/或C-3位置的羧基处发生甲基化或在羟基处发生乙酰化。

果胶乙酰酯酶催化线性的同型聚半乳糖醛酸(无毛)区羧基处的乙酰基发生脱乙酰作用。鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶催化高度分支的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(有毛)区羟基处的乙酰基发生脱乙酰作用。

已经由菊欧文菌(Erwinia chrysanthemi)(Shevchik等人，1997，分子微生物学(Molecular Microbiology)24：1285-1301)；豇豆(Vigna radiataL)(Breton等人，1996，FEBS通讯(FEBS Letters)388：139-142)；和黑曲霉(Aspergillus niger)(Searle-VanLeeuwen等人，1996，生物技术进展(Progress in Biotechnology)，第793-798页)分离了果胶乙酰酯酶。

已经由棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(Kauppinen等人，1995，生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)270：27172-27178；WO 93/20190)分离了鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶。

已经由菊欧文菌分离了编码果胶乙酰酯酶的基因(Shevchik等人，1997，见上文)。

已经由棘孢曲霉分离了编码鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶的基因(Kauppinen等人，1995，见上文)。

本发明的一个目的是提供具有果胶乙酰酯酶活性的改进多肽和编码该多肽的核酸。

                      发明概述

本发明涉及选自下组的具有果胶乙酰酯酶活性的分离多肽：(a)具有与SEQ ID NO：2的第26-382位氨基酸具有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在低严谨条件下与(i)SEQ ID NO：1的第76-1146位核苷酸，(ii)至少100个核苷酸的(i)的亚序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链发生杂交的核酸序列编码的多肽；(c)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽包含一个或多个氨基酸的替代、删除、和/或插入的变体；(d)(a)或(b)的等位基因变体；和(e)(a)、(b)、或(d)的具有果胶乙酰酯酶活性的片段。

本发明还涉及编码多肽的分离核酸序列，包含该核酸序列的核酸构建物、载体、和宿主细胞，以及生成和使用所述多肽的方法。

                      图的简述

图1显示枯草芽孢杆菌168果胶乙酰酯酶的基因组DNA序列和推导氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：1和2)。

图2显示pDG268MCS的限制性图谱。

图3显示pHP13amp-MCS的限制性图谱。

图4显示pHP13amp-SAV的限制性图谱。

图5显示pUC18-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/cryIIIA的限制性图谱。

图6显示pDG268MCS-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV的限制性图谱。

图7显示pDG268MCSΔ-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV的限制性图谱。

图8显示pDG268MCSΔneo-Pr_cryIIIA/cryIIIAstab/SAV的限制性图谱。

图9显示包含“共有”amyQ启动子的核酸序列。

图10显示pDG268MCS-Pr_{“短共有”amyQ}/SAV的限制性图谱。