[发明专利]具有灭活的DNA错配修复系统的真菌细胞

说明书

                          发明领域

一种利用新颖的克隆基因制备丝状真菌细胞DNA文库的方法，该基因参与丝状真菌细胞的错配修复系统。

                          发明背景

错配修复系统是细胞内识别新合成的双链DNA序列中的错配的系统。

错配修复系统然后可利用甲基化的“旧”株系作为模板纠正被察觉为错误的错配，或者可以介导包含错配的双链DNA序列的降解。

独立于精确的机理之外，最终结果将是“错配修复系统”将限制细胞内的“多样性”，多样性表现为包含错配的双链DNA序列。

例如，包含单一错配的双链DNA序列代表细胞内两种不同的DNA序列的多样性。如果错配修复系统纠正错配，那么在细胞内将只有一种DNA序列。

或者，如果错配修复系统介导这样一种双链DNA序列的降解，那么多样性将消失。参见图1，其以图解方式阐述错配修复系统在细胞内是如何工作的。

所以，如果包含错配的双链DNA序列代表目的DNA文库，那么当转化(放置)到具有活性错配修复系统的细胞内时，该文库的多样性可以受到限制。

本领域提供了一种该问题的解决方案，即制备其中错配系统已失活的细胞。

EP449923描述了其中错配系统被灭活的细菌细胞。

WO97/37011描述了其中错配系统被灭活的酵母细胞。参见该文献的工作例。

WO97/05268描述了其中错配系统被灭活的小鼠细胞。参见该文献的工作例。

                         发明概述

本发明所要解决的问题是提供制备丝状真菌细胞DNA文库的改进策略。包含这样一种DNA文库的丝状真菌细胞群体因而可以用于选择目的多肽。还可以选择具有特定性质的多核苷酸序列，例如具有改变/改进性质的启动子、终止子和其它调节元件。

解决方案的基础是发明人已经克隆了参与丝状真菌细胞错配修复系统的新基因。此外，该基因是第一种被克隆的参与丝状真菌细胞错配修复系统的基因。

通过灭活丝状细胞中的这种基因，有可能获得这样的丝状细胞，它在其错配修复系统中有缺陷，并且对制备丝状真菌细胞中的DNA文库来说是非常有用的。

该基因包含非常有特性的编码如SEQ ID NO 2之683-758位所示多肽序列的DNA序列。

该DNA已经用于克隆编码如SEQ ID NO 2之1-940位所示多肽序列的全长基因。参见本文的工作例(见下)。

如本文工作例所述被克隆的基因是从米曲霉丝状真菌细胞克隆的基因。

不过，基于本文所提供的新序列信息，对本领域技术人员来说从其他丝状真菌细胞克隆相似的同源基因是例行工作，例如使用标准的杂交或PCR技术，优选地使用编码SEQ ID NO 2之683-758位所示多肽序列的DNA序列作为制备杂交探针或PCR引物的基础。

因此，本发明在第一方面涉及丝状真菌细胞，其中参与错配修复系统的基因已经被灭活，该参与错配修复系统的基因包含：

(a)编码SEQ ID NO 2之683-758位所示多肽序列的DNA序列；或

(b)编码至少70％等同于SEQ ID NO 2之683-758位的多肽序列的DNA序列；

本发明在第二方面涉及丝状真菌细胞，其中参与错配修复系统的基因已经被灭活，该参与错配修复系统的基因包含：

(a)编码SEQ ID NO 2之1-940位所示多肽序列的DNA序列；或

(b)编码至少70％等同于SEQ ID NO 2之1-940位的多肽序列的DNA序列。

如上所述，本发明第一或第二方面的丝状真菌细胞非常适合于制备丝状真菌细胞中目的DNA文库。

因此，本发明在第三方面涉及制备丝状真菌细胞群体的方法，其中群体中的个体细胞分别包含代表目的DNA文库的不同目的DNA序列，该方法包括下列步骤：

(a)分别将不同的目的DNA序列放置在包含本发明第一或第二方面丝状真菌细胞的丝状真菌细胞群体中；

(b)将(a)群体生长一段时间，使群体中单个目的DNA序列在本发明第一或第二方面错配修复系统基因已被灭活的条件下复制至少一次。