[发明专利]带有人lgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子的制备方法及其制品的用途

说明书

本发明属于基因工程领域，特别涉及带有人IgG₁Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子的制备方法及其制品的用途。

癌症在全世界已成为仅次于的脑血管疾病的人类第二大杀手，是目前世界上最难征服的疾病之一。目前实体肿瘤临床疗法绝大部分是针对肿瘤细胞进行的，从根本上用抑制剂或阻断剂来阻断或抑制实体肿瘤血管再生及血液供应方面的疗法却很少，用带有人IgG₁Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子--Endostatin蛋白进行抗肿瘤血管再生治疗在国内外尚未见报道。另外重组人的血管内皮细胞生成抑制因子大多是在大肠肝菌中表达，其表达量仅为15-20mg/升菌液，且可溶性差，生物活性低。

本发明的目的在于提供一种在酵母菌中高效表达的、可溶性的、无需复性、修饰及糖基化的、高活性带有人IgG₁Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子，用于抗肿瘤治疗。

本发明方法步骤如下：

a.通过PCR方法从人胎儿肾脏细胞cDNA文库中筛选得到人胶原蛋白十八--human typeXVIII collagen基因1503至2055cDNA活性片段，首先合成两种引物分别为CCGCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTCACAGC和CGCGGATCCACCACCTCCCTTGGAGGCAGTCATGAAGCT，以人胎儿肾脏细胞cDNA库为模板，以PCR条件94℃2分钟、55℃2分钟和72℃2分钟共做30个循环得到重组人血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin基因片段；

b.将所得基因片段克隆入TA Vectohk质粒中，通过两种内切酶酶切，经电泳纯化得到576bp基因片段；

c.然后再合成两种引物：GGT GGA TCC GGT GGA GGA GGA AGCGGA GGT GGA GGG TCC GTC GAC AAA ACT CAC和CCG CGG CCGCCG CAC TCA TTT ACC CGG AGA CAG，以人胎儿肾脏细胞cDNA库为模板，以PCR条件94℃2分钟、55℃2分钟和72℃2分钟共做30个循环得到人IgG₁Fc基因片段；

d.将所得的基因片段克隆入TA Vectohk质粒中，通过两种内切酶酶切，经电泳纯化得到的729bp基因片段；

e.将克隆得到的两个基因片段用连接酶连接后再克隆入pPICZαA质粒的两种内切酶位点中，构成PLW205基因载体；

f.将得到的基因载体PLW205转入X--33酵母菌中，构成基因工程菌株，用平板培养得到抗性菌株，经筛选得到高效表达的基因工程酵母菌株；

g.经发酵诱导表达的菌液采用生物分离技术等手段纯化得到带有人IgG₁Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子蛋白质；

h.将纯化得到的带有人IgG₁Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子Endostatin蛋白加入到含有bFGF的牛肾上腺毛细血管内皮细胞培养液中，培养3天后通过细胞计数和细胞染色方法，测定抑制毛细血管内皮细胞增殖的活性。

上述得到的制品具有以下特性：

a.其基因载体为PLW205质粒，其质粒表达启动子为醇氧化酶AOX1，替换酵母天然的醇氧化酶基因；

b.PLW205内构建α-因子带有分泌信号肽序列，目的蛋白分泌于细胞外；

c.其基因工程宿主酵母菌为甲醇诱导型；

d.其制品为可溶性、无需复性和修饰的具有生物活性的蛋白质。

带有人IgG₁Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin蛋白，其制品作为单制剂制备成生物制品用于抗肿瘤治疗。

本发明与现有技术相比较具有如下优点：

(1)采用带有人IgG₁Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin的基因产物用于治疗人实体肿瘤属于同源性，而不易被人体所排斥，其效果优于用鼠重组Endsotatin蛋白。

(2)带有人IgG₁Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin基因是在酵母菌中表达，属甲醇诱导型，表达量高达60-80mg/升菌液，其蛋白产物属分泌型，为可溶性无需复性和修饰的高活性天然状态蛋白质。