[发明专利]带有人lgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子的制备方法及其制品的用途

权利要求书

1.一种带有人IgG₁Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin的制备方法是经过基因克隆、酵母菌发酵和纯化过程制备而得，其步骤如下：

a.通过PCR方法从人胎儿肾脏细胞cDNA文库中筛选得到人胶原蛋白十八--human typeXVIII collagen基因1503至2055cDNA活性片段，首先合成两种引物分别为CCGCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTCACAGC和CGCGGATCCACCACCTCCCTTGGAGGCAGTCATGAAGCT，以人胎儿肾脏细胞cDNA库为模板，以PCR条件94℃2分钟、55℃2分钟和72℃2分钟共做30个循环得到重组人血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin基因片段；

b.将新基因片段克隆入TA Vectohk质粒中，通过两种内切酶酶切，经电泳纯化得到的576bp基因片段；

c.然后再合成两种引物：GGT GGA TCC GGT GGA GGA GGA AGCGGA GGT GGA GGG TCC GTC GAC AAA ACT CAC和CCG CGG CCGCCG CAC TCA TTT ACC CGG AGA CAG，以人胎儿肾脏细胞cDNA库为模板，以PCR条件94℃2分钟、55℃2分钟和72℃2分钟共做30个循环得到的人IgG₁Fc基因片段；

d.将上述基因片段克隆入TA Vectohk质粒中，通过两种内切酶酶切，经电泳纯化得到的729bp基因片段；

e.将克隆得到的两个基因片段用连接酶连接后再克隆入pPICZαA质粒两种内切酶位点中，构成PLW205基因载体；

f.将上述基因载体PLW205转入X--33酵母菌中，使用平板培养得到抗性菌株后，经筛选得到高效表达的基因工程酵母菌株-LW205；

g.经发酵诱导表达的菌液采用生物分离技术等手段纯化得到的带有IgG₁Fc重组人血管内皮细胞生成抑制因子Endostatin蛋白质；

h.将纯化得到的带有IgG₁Fc重组人血管内皮细胞生成抑制因子Endostatin蛋白加入到含有bFGF的牛肾上腺毛细血管内皮细胞培养液中，培养3天后通过细胞计数和细胞染色方法，测定抑制毛细血管内皮细胞增殖的活性。

2.根据权利要求1所述得到的制品具有以下特性：

a.其基因载体为PLW205质粒，其质粒表达启动子为醇氧化酶AOX1，替换酵母菌天然的醇氧化酶基因；

b.PLW205质粒内构建α-因子带有分泌信号肽序列，可使目的蛋白分泌于细胞外；

c.其基因工程宿主酵母菌为甲醇诱导型；

d.其制品为可溶性、无需复性和修饰的具有生物活性的蛋白质。

3.一种带有人IgG₁Fc分子结构片段的重组人血管内皮细胞生成抑制因子--Endostatin其制品作为单制剂制备成生物制品用于治疗实体肿瘤。