[发明专利]重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因工程酵母菌及生产方法

说明书

本发明涉及重组人碱性成纤维细胞生长因子基因工程酵母菌PichiaPastoris的构建及使用该菌制备rhbFGF的方法。

在国内外报导的有关碱性成纤维细胞生长因子基因工程的工作，大部分是采用大肠杆菌(E.coli)表达系统。虽然大肠杆菌在基因工程领域被广泛地选用，但是由于它属于原核生物，对真核生物蛋白的正确表达存在一定的缺陷。而酵母作为异源蛋白的表达宿主，克服了大肠杆菌的缺点，体现在表达蛋白可以正确折叠、糖基化等，是真核生物蛋白的良好表达宿主。有关酵母表达系统的早期研究工作大多集中在酿酒酵母。酿酒酵母表达系统存在的不足之处是，不易实现高密度培养、表达效率低、对外源基因表达产物的分泌不够理想，以及翻译后加工方面与高等真核生物存在不同，存在过度糖基化问题，使其表达产物有很强的抗原性而不能用于药物。酿酒酵母的这些不足，促使人们研究开发新的酵母表达系统，目前已报道的有巴斯德毕赤酵母、多型汉逊酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、解脂耶鲁酵母、施旺酵母等系统，统称为非常规酵母表达系统，其中，尤其是甲醇营养型酵母表达系统，由于其具有独特的优点，近年来日益引起人们的重视。巴斯德毕赤酵母具有如下优点：

(1)含特有的AOX(醇氧化酶基因)启动子，用甲醇可以严格地调控表达；

(2)有完备的发酵方法，可以高密度连续培养，细胞干重达100g/L以上，

   外源蛋白表达产量高；

(3)表达质粒易于整合到基因组，稳定性高，不易丢失；

(4)胞内存在过氧化物酶体，表达产物进入过氧化物酶体，能使表达产物免

   受蛋白酶降解或使细胞免受外源蛋白毒害。

本发明的目的在于构建一种能够在胞内或胞外高效表达bFGF的酵母工程菌Pichia Pastoris。

本发明将碱性成纤维细胞生长因子基因克隆到酵母高效表达载体中，利用锂盐法转入酵母。通过PCR技术和地高辛(DIG)标记的探针从转化子中筛选出十个高拷贝的含有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因的菌株。实验室里用进行摇瓶发酵表达，表达量约为20-100mg/L，因此有很好的工业发酵前景。

本发明基于前期的碱性成纤维细胞生长因子基因序列的测定和酵母，尤其是甲醇营养型毕赤酵母Pichia Pastoris的优越性，构建了一种高效表达的重组人碱性成纤维细胞生长因子基因工程酵母菌，为开发基因工程新药打下基础。1.菌株及质粒

所用菌株和质粒见表1。