[发明专利]DNA足纹步移作图法

说明书

本发明涉及研究基因转录调控的方法，具体地说是研究DNA与蛋白质相结合的精确位点的作图法。

DNA足纹法已应用较广泛，卢圣栋主编的《现代分子生物学实验技术》高等教育出版社，1993年7月第一版，P490～494对足纹法进行了详细描述。足纹法通常包括以下步骤：(1)采用PCR扩增或限制性核酸内切酶消化获得DNA靶分子；(2)在一定条件下用某些化学试剂或酶对同位素标记的双链靶DNA进行随机降解；(3)进行变性聚丙烯酰胺凝胶电脉；(4)放射自显影，分析DNA梯队中形成的位置缺口，并确定DNA与蛋白质相结合的精确位点。该方法的主要缺点是在进行DNA足纹法之前必须经过报告基因分析和EMSA试验证实某一段DNA具有转录活性和存在蛋白质的结合位点，且对片段的长度有一定限制，一般低于400bp较理想，当结合位点离标记末端300bp或更远时，需要更长的电脉时间而且DNA片段梯队带型将很不尖锐，信号较弱，从而难以确定DNA与蛋白质相结合的精确位点。因此，进行长片段DNA足纹分析时需要将DNA片段切割成小片段，再进行多次标记，多次结合，多次消化，步骤繁琐、费时，消耗昂贵的核蛋白较多。

本发明的目的在于提供一种无需先进行报告基因分析和EMSA等初筛实验，可以一次性绘制出任意长度DNA片段上存在的蛋白质结合位点图，且带型更尖锐，更清晰，还可以节省昂贵的核蛋白的DNA足纹步移作图法。

本发明的方法包括以下步骤：(1)采用PCR扩增或限制性核酸内切酶消化获得DNA靶分子；(2)在一定条件下用某些化学试剂或酶对未标记的双链靶进行随机降解；(3)以这些降解后的DNA分子作模板，用条数n=靶DNA长度(bp)／300bp，经同位素标记的该基因特异性的引物进行单链扩增；(4)进行变性聚丙烯酰胺凝胶电脉；(5)放射自显影，分析结果。

由于采用这种用足够多条特异性引物对被随机降解靶DNA分子模板进行单链扩增，保证了无论是被蛋白质所保护的区域，还是未被蛋白质结合区域的整个DNA片段均被扩增，又获得大量长度不一的标记单链DNA分子，从而使放射性信号更为集中，带型更尖锐、更清晰，从而实现了不需要先进行报告基因分析和EMSA初筛实验，而可以一次性对任意长度DNA片段存在的蛋白质结合点进行精确的分析，使该足纹法更简便、快速，并大大节约了核蛋白的用量。

实施例1：

用DNA足纹步移作图法对人体干细胞因子[hscf]基因5’调控序列(-1190～-273)进行分析。采用以下步骤：

1、用引物T7和SP6扩增重组质粒PGEM-SCF5’(本课题组构建)，获得hscf下基因5’调控序列945bp(-1190～-273)并纯化。

2、100μL反应体系中含100ng945bp探针，30～80μgHeIa核抽提物，1×结合缓冲液；对照组不加HeLa核抽提物，室温下孵育30分钟，后加入CaCl₂／MgCa缓冲液100μl，室温下放置1分钟，加入1单位DNase I，室温下放置1分钟，加入37℃终止缓冲液200μl，无水乙醇沉淀DNA片段，离心分离，DNA沉淀于100μl无菌水中溶解；

3、取以上经降解DNA溶液1μl为模板，用[r-p³²]ATP标记的T7和SP6引物扩增，同时进行A+G反应为对照；

4、以上扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电脉；

5、-70℃放射自显影，并分析。结果如下：

Lane1～4采用T7引物对hSCF(human stem cell factor)基因5’调控序列自-1190进行DNA足纹步移作图分析。Lanel，A+G反应；Lane2，100ng945bp探针，无核蛋白结合对照；Lane3，100ng945bp探针加30μgHeIa核抽提物；Lane4，100ng945bp探针加80μgHeIa核抽提物。DNA与蛋白质结合区已于图中注明。Lane5～8采用SP6引物对hSCF(human stem cell factor)基因5’调控序列自-273进行DNA足纹步移作图分析。Lane1，A+G反应；Lane2，100ng945bp探针，无核蛋白结合对照；Lane3，100ng945bp探针加30μgHeIa核抽提物；Lane4，100ng945bp探针加80μgHeIa核抽提物。DNA与蛋白质结合区已于图中注明。