[发明专利]有效检测HIV－1和HIV－2的寡核苷酸逆转录引物及其应用方法

说明书

本发明涉及改进的检测生物样品核酸序列的方法，特别是检测来源于感染性微生物的序列的方法。

全世界数百万人感染有人免疫缺陷病毒(HIV)。因此，HIV感染成了严重的社会健康问题。HIV感染经过污染的血液制品传播，这就意味着迫切需要能够在患者的样品中检测出少量HIV RNA的筛选方法。而且，改进的HIV感染治疗方法有效性的提高意味着感染患者的早期检测非常重要，以便开始进行适宜的治疗。

因此，本领域中需要可用于诊断和筛选的高度敏感的HIV的检测方法。

本发明提供一种逆转录生物样品中人免疫缺陷病毒(HIV)RNA的方法，此方法包括：

(a)用一种寡核苷酸与来源于上述样品的RNA接触，条件是其中所述的寡核苷酸引发与上述RNA的至少一部分互补的DNA的合成；

其中所述的寡核苷酸选自下列寡核苷酸组成的组：

    (i)5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列1>、

    (ii)5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列2>、

    (iii)5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列3>、

    (iv)5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列4>、或者

    (v)上述的任意组合。

另一方面，本发明提供一种检测生物样品中人免疫缺陷病毒(HIV)RNA存在的方法，此方法包括：

(a)进行逆转录反应，用来源于样品的RNA作为一种模板，并且用一种寡核苷酸产生HIV-特异性逆转录产物，此寡核苷酸与RNA中所包括的核苷酸序列互补，它在此为一种引物，

其中的引物选自由下列组成的组：

    (i)5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列1>、

    (ii)5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列2>、

    (iii)5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列3>、

    (iv)5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列4>、或者

    (v)上述任意的组合；

(b)扩增逆转录反应的产物以产生扩增产物；以及

(c)检测扩增产物；

其中扩增产物的检出显示样品中HIVRNA的存在。

扩增可以通过任何方法完成，优选聚合酶链反应(PCR)。本发明HIV-特异性逆转录引物的使用提供了一种用于检测样品(优选血浆)中HIV-1和/或HIV-2的敏感的方法。

再一方面，本发明提供了检测生物样品中HIV-1、HIV-2、或其组合的试剂盒，其中试剂盒包括一种逆转录引物，该引物选自由下列组成的组：

    (a)5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列1>、

    (b)5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列2>、

    (c)5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列3>、

    (d)5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列4>、或者

    (e)上述任意的组合。

此试剂盒还可以包括用于逆转录、扩增和产物检测的试剂和说明。

附图1是用溴化乙锭染色的4％琼脂糖凝胶的显影说明，它显示应用(a)随机六聚体引物(泳道2-10)；或(b)随机六聚体引物和LTR8RT的混合物(泳道12-20)作为一种逆转录引物而获得的HIV-1-特异性扩增产物。泳道1含有标记物，泳道22、24和26为对照样品。

附图2是用溴化乙锭染色的4％琼脂糖凝胶的显影说明，它显示应用(a)随机六聚体引物和POL3RT的混合物(泳道2-10)或(b)LTR8RT和POL3RT的混合物(泳道12-20)作为一种逆转录引物而获得的HIV-1-特异性扩增产物。泳道1含有标记物，泳道22、24和26为对照样品。

附图3是用溴乙锭染色的4％琼脂糖凝胶的显影说明，它显示应用(a)随机六聚体引物(泳道2-13)或(b)随机六聚体引物与POL3RT、LTR8RT、2LTRRT和2EnvRT的混合物(泳道15-26)而获得的HIV-1-特异性扩增产物。泳道1含有标记物。