[发明专利]β,β－胡萝卜素15,15'－二加氧酶

说明书

本发明涉及β，β-胡萝卜素15，15′-二加氧酶(EC1.13.11.21)的克隆，该酶负责裂解β-胡萝卜素生成维生素A。本发明所定义的术语维生素A包含一类化合物，包括视黄醛、视黄醇、3-脱氢视黄醇、视黄酸、这些化合物的异构体以及视黄基酯。具有β，β-胡萝卜素15，15’-二加氧酶活性的蛋白质及其编码核酸序列可用于不同的领域，包括但不限于诊断、维生素A的制备工艺、为了在果类和蔬菜中生成维生素A而产生转基因植物、或基因疗法。

维生素A对人和动物来说是必不可少的，在多数有机体内多半是由其前体类胡萝卜素生成的，类胡萝卜素只能单独在植物、光合活性的和某些其他微生物中合成。人和多数动物(特别是草食动物和杂食动物)能够在酶作用下将这些类胡萝卜素-也被称为维生素原A-转化为维生素A。该过程最重要的酶是β，β-胡萝卜素15，15’-二加氧酶(EC1.13.11.21)。该酶位于细胞溶质中，按照流程I，在氧的存在下，从主要的底物β-胡萝卜素生成视黄醛：

β，β-胡萝卜素15，15’-二加氧酶的特征在于通过中间裂解，从1molβ-胡萝卜素生成2mol视黄醛。但是该酶也能够将多种类胡萝卜素转化为维生素A活性化合物，如流程II所示。

流程II     β-胡萝卜素                                      α-胡萝卜素                                     R’＝OH，O或任意                                   R^-＝CHO，COOH，COOR，                                               C₂H₂-CHO，C₂H₂-COOH，C₂H₂-COOR                                               C₅H₆-CHO，C₅H₆-COOH，C₅H₆-COOR或任意                                                而R＝烷基或任意

已知的最高酶活性是在草食动物的肠道中发现的，尤其是在十二指肠中。在其他组织中，如肝、肺、肾和脑，也可检测到β，β-胡萝卜素15，15′-二加氧酶。从1995年开始，为了用生化方法对该酶进行提纯和特征鉴定，人们付出了大量努力[Goodman(1965，1955)，Fidge(1969)，Laksmanan(1972)，Sharma(1977)和Devery & Milborrow《英国营养学杂志》(1994)72，p.397-414]。不过，这些努力都未曾获得成功。比活性即每mg蛋白质每小时生成600pmol视黄醛还没有被超过。

在本发明的过程中，可以将小鸡酶提纯到可得到部分氨基酸序列的程度。将该酶浓缩226倍。得到比活性为2500pmol/h/mg。来自最终的凝胶过滤部分的聚丙烯酰胺凝胶上，考马斯蓝染色后可见到15条带。有两条带与酶活性有关。对第一种蛋白质进行埃德曼排序，对第二种进行MS光谱分析。胰蛋白酶凝胶内消化和随后的微孔RP-HPLC肽绘图结合后一种蛋白质的MALDI-TOF MS和自动埃德曼降解，揭示了11氨基酸和18氨基酸的2种肽。由该序列信息，设计和合成了简并PCR引物。

按照PCR方案，将51bp(碱基对)片段在较长的肽中扩增。由该序列合成了同源引物，并在第二步RT-PCR(逆转录酶-PCR)中用其来扩增597bp片段。

为了分离编码β，β-胡萝卜素15，15′-二加氧酶的全长cDNA，对该cDNA片段进行放射性标记，用于从小鸡表达文库中筛选出两种阳性库。

从用于在细胞反式激活测定法中筛选β，β-胡萝卜素15，15′-二加氧酶活性的小鸡十二指肠的cDNA文库得到阳性库。通过这种方法，鉴定了若干阳性cDNA库。结合这两种方法，可以成功地克隆编码β，β-胡萝卜素15，15′-二加氧酶的基因。

本发明的一个目的是提供具有产生维生素A的β，β-胡萝卜素15，15′-二加氧酶活性的蛋白质，该蛋白质包含等同于或同源于1号序列ID(如图4所示)的氨基酸序列，其中与1号序列ID的同源程度至少为60％。